（1、楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心；2、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 3、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院；4、揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇 南京，210095）

　　摘要:近來，眾多豬場出現(xiàn)新生仔豬腹瀉高發(fā)病情況，應(yīng)用抗生素治療無明顯效果，死亡率很高，有些嚴(yán)重發(fā)病的豬場哺乳仔豬整窩出現(xiàn)腹瀉相繼死亡，導(dǎo)致豬場損失慘重。豬群發(fā)病特點(diǎn)表現(xiàn)為母豬與新生仔豬同時(shí)具有臨床癥狀，母豬主要表現(xiàn)為產(chǎn)前產(chǎn)后便秘，產(chǎn)后發(fā)燒不食、少奶甚至無奶、拉水樣糞；新生仔豬初期表現(xiàn)為黃色水樣或溶糖狀腹瀉物，有臭味，腹瀉、嘔吐，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閯×宜畼痈篂a、允乳無力、仔豬體質(zhì)快速瘦弱最后衰竭死亡。鑒于此嚴(yán)重情況，我楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心立即組織專家力量，在全國范圍內(nèi)深入各地豬場做臨床調(diào)查并取發(fā)病仔豬病料開展實(shí)驗(yàn)室診斷。

　　關(guān)鍵詞: 新生仔豬、病毒性腹瀉、肽核酸

　　我中心在與泰國等東南亞地區(qū)農(nóng)場及國內(nèi)眾多豬場交流后發(fā)現(xiàn)這種新生仔豬的腹瀉問題相當(dāng)普遍，對養(yǎng)豬生產(chǎn)已造成了不小損失，需引起同行重視并盡快研究出控制措施與方案。經(jīng)過臨床調(diào)查結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷研究分析，近來的產(chǎn)房母豬和新生仔豬腹瀉病癥主要與多種病毒共感染相關(guān)，故暫命名為“新生仔豬腹瀉綜合征(NPDS)”。

　　由于病毒持續(xù)侵染母豬淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，形成感染壓力后致使母豬免疫機(jī)能衰弱，便秘、體況不良、食欲不佳、產(chǎn)程過長、奶水不足、產(chǎn)道感染率增加等一系列亞臨床癥狀及死胎、流產(chǎn)、返情率增高等繁殖障礙現(xiàn)象。受病毒感染壓力的影響，在妊娠后期病毒易通過胎盤屏障垂直傳染給胎兒幾率增加，新生仔豬先天性帶毒及出生后即在母豬排毒污染嚴(yán)重的環(huán)境中與母豬一起生活，免疫系統(tǒng)頻繁遭受病毒攻擊致使原本尚未發(fā)育成熟的免疫系統(tǒng)損傷嚴(yán)重，再加上目前是冬春季節(jié)交換，日夜溫差與氣候變化劇烈，故出現(xiàn)高發(fā)病高死亡率。

　　為探究發(fā)病原因，我們將從廣東、廣西、福建、江西、湖南、江蘇、安徽、湖北、河南共9個(gè)省區(qū)采集的28個(gè)病料樣本（十二指腸、淋巴結(jié)、肺臟、扁桃體、血液）處理，嘗試分離豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒、流行性腹瀉病毒。

　　一、 病料處理

　　分別取解凍的待檢病料10g左右（在冰上進(jìn)行操作），用滅菌的手術(shù)剪剪碎，加入適量的生理鹽水或PBS溶液（pH7.2)混勻，用滅菌的研磨器充分研磨，再用2ml Eppedorf管分裝，反復(fù)凍融2-3次，4℃冷凍離心機(jī)離心8000r/m，10min，取上清液，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　二、 病毒液、病料中病原DNA模板的制備

　　2.1圓環(huán)病毒及偽狂犬病毒的DNA提取

　　取447.5ul上清液，加50uL10%的SDS，震蕩混勻；加入2.5uL蛋白酶（PEK），混勻；放入58℃水浴鍋中，充分裂解2h，再加入水飽和酚250ul，三氯甲烷240ul，異丙醇10ul，混勻，12000轉(zhuǎn)/分離心5min；取上清400ul加1/10體積的醋酸鈉40ul，2倍體積的無水乙醇800ul，混勻，置于-20℃進(jìn)行DNA沉淀1h；12000r/m離心20min，棄去上清，加入1000ul 70%乙醇洗滌沉淀，再棄去上清進(jìn)行干燥，干燥后加入滅菌雙蒸水50ul將DNA溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2.2豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒及輪狀病毒的RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

　　采用天澤基因生產(chǎn)的柱式動物RNAout試劑盒提取樣品RNA。按照說明書提取，樣品管中A液和B液各加450ul，再加入300ul樣品上清液，混勻；加氯仿250ul，混勻，12000r/m離心5min，取700uL無色透明水相于通用離心柱中，12000r/m離心1min，加入通用洗柱液700ul，再重復(fù)離心步驟；棄去離心吸附柱，換成離心管，每管加50ul洗脫液，再次離心1min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系：DEPC 6uL+RNA 5ul+引物 1ul+dNTP 2ul,65℃反應(yīng)2min，在降溫至4℃保持5min。再向反應(yīng)管中加入5*buffer 4ul+Ribolock Rnase Inhibitor 1ul+M-MLV 1ul，30℃反應(yīng)10min。

　　三、 引物設(shè)計(jì)與合成

　　根據(jù)基因文庫提供的和已發(fā)表的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PEDV序列，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件DNAstar在保守區(qū)域基因序列保守區(qū)的五對引物。該引物設(shè)計(jì)完成后, 通過計(jì)算機(jī)網(wǎng)站(http://www.ncbi. Nlm.nih.gov/BLAST/)對其進(jìn)行分析，結(jié)果具有良好的特異性。引物序列如下：

　　CSFV 上游引物:5’-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3’

　　下游引物:5’-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3’

　　PRRSV 上游引物: 5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’

　　下游引物: 5’-AGCTCGTTTCATGCTGAGGGTGA-3’

　　PRV 上游引物: 5’-AGGACGAGTTCAGCGACG-3’

　　下游引物: 5’-AACAGGCGGTTGGCGGTCAC-3’

　　PCV2 上游引物: 5’-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTA-3’

　　下游引物: 5’-AAATTCAGGGCATGGGGGGGAA-3’

　　PEDV 上游引物:5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3’

　　下游引物:5’-GATCCTGTTGGCCATCC-3’

　　四、 PCR擴(kuò)增及鑒定

　　采用天澤基因PCR試劑盒，30ul反應(yīng)體系：DNA（cDNA） 2-4uL+PCR Mix 15ul+引物1-2ul+滅菌雙蒸水 9-11ul，采用95℃預(yù)變性5min，94℃50s，52-59℃不同溫度進(jìn)行退火50s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存。

　　五、 結(jié)果與分析

　　病原分析結(jié)果如下（表1.）

　　六、預(yù)防控制思路

　　據(jù)調(diào)查研究顯示，我國及東南亞地區(qū)目前新生仔豬腹瀉高發(fā)病率高死亡率與母豬群遭受野毒持續(xù)侵染，形成感染壓力呈正相關(guān)，凡是便秘、體況不良、食欲不佳、產(chǎn)程過長、奶水不足、乳房炎與子宮炎及返情、產(chǎn)死胎率高的母豬群所產(chǎn)的新生仔豬發(fā)生腹瀉病率顯著的增高。另外,國內(nèi)豬場母豬貢獻(xiàn)成品肉豬的生產(chǎn)水平普遍不到發(fā)達(dá)養(yǎng)豬國家的60%，大量的種豬存在不同程度的繁殖障礙，由于母豬的生產(chǎn)性能低下，又加上疾病的頻頻發(fā)生，豬場的盈利危機(jī)四伏。在豬場中有著相當(dāng)多的公豬表現(xiàn)死精、弱精、甚至無精；母豬表現(xiàn)出的屢配不孕、死胎、流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亞臨床現(xiàn)象。存在的這些現(xiàn)象中，有超過80%是由于野毒在種豬群中循環(huán)并持續(xù)侵染種豬的生殖系統(tǒng)上皮細(xì)胞，導(dǎo)致卵巢、輸卵管、子宮、精囊腺、睪丸等組織器官細(xì)胞大量凋亡。

　　俗話說的好，母豬好好一窩、公豬好好一坡，在哺乳母豬飼喂過程中，采用疫百特（肽核酸---一種新型的抗病毒添加劑技術(shù)）添加到哺乳母豬料中，對母豬群實(shí)施病毒感染良好控制與凈化方案是解決這些問題的關(guān)鍵！

　　七、發(fā)病豬群臨床控治措施

　　7.1 國內(nèi)豬場相關(guān)產(chǎn)品配套方案

　　A:母豬，分娩當(dāng)天肌注疫百特注射液6-8ml/頭份，間隔3天各肌注一次，1-2次/療程。

　　B:吃奶的新生仔豬，肌注疫百特注射液0.1ml/頭份（<3kg體重） 、0.2ml/頭份（3-7kg體重），可與疫苗或補(bǔ)鐵同針肌注，間隔2天各肌注一次，2次/療程；或疫百特注射液0.2ml+霉克樂5-10g/頭份灌服（即：以10頭豬/窩計(jì)，分別取疫百特注射液2ml和霉克樂50-100g加入200ml熱開水中攪拌形成混懸液，用一次注射器吸取20ml灌入乳豬口中咽下，1-2次/日。）

　　C:正常采食的發(fā)病豬群采用疫百特60 1000g+菌特肽克2000g+霉克樂2000g/噸全價(jià)料，連續(xù)飼喂7-10天。

　　D:搞好豬圈環(huán)境衛(wèi)生、干燥、溫暖。

　　7.2 國外豬場相關(guān)產(chǎn)品配套方案

　　• 發(fā)病豬肌注YebatonTMInj.+阿托品(功能:緩解消化道平滑肌蠕動、止瀉)，兩天一次，連續(xù)肌注3-5次。

　　• 母豬，分娩當(dāng)天肌注YebatonTMInj.6-8ml/頭份，間隔3天各肌注一次，1-2次/療程。

　　• 吃奶的新生仔豬，肌注YebatonTMInj. 0.1ml/頭份（<3kg體重） 、0.2ml/頭份（3-7kg體重），可與疫苗或補(bǔ)鐵同針肌注，間隔2天各肌注一次，2次/療程；或YebatonTMInj. 0.2ml+ MILDRID™Plus 5-10g/頭份灌服（即：以10頭豬/窩計(jì)，分別取YebatonTMInj. 2ml和MILDRID™Plus 50-100g加入200ml熱開水中攪拌形成混懸液，用一次注射器吸取20ml灌入乳豬口中咽下，1-2次/日。）

　　• 正常采食的發(fā)病豬群采用YebatonTM200 500g+ SAFETM Antide 1000g+MILDRID™Plus2000g/噸全價(jià)料，連續(xù)飼喂7-10天。

　　• 搞好豬圈環(huán)境衛(wèi)生、干燥、溫暖。